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学术文章

王钢论文《中成药》积雪草对大鼠系膜细胞转化

来源:未知 作者:njboda 时间:2014-10-30 20:31

文献出处:《中成药》 2003年4月第25卷第4期

积雪草对大鼠系膜细胞转化生产因子-β1的影响

黄怀鹏1 ,  王 虹2 ,  王 钢1

(1. 江苏省中医院肾病实验室,江苏南京210029;

 2. 天津中医学院中心实验室,天津300193)

    关键词:积雪草,系膜细胞,转化生长因子---β1

    中图分类号:R285. 5   文献标识码:B    文章编号:100121528 (2003) 0420330202

   积雪草为伞形科植物,具有清热利湿、解毒散瘀活血的作用,本品始载于《神农本草经》列为中品。谓本品“主大热,恶疮,痈疽,浸淫,皮肤赤,身热”。《陆川本草》进一步言其能“解毒,泻火,利小便。治热性头痛、身热、口渴、小便黄赤”。近年国内逐渐应用于慢性肾脏病的治疗。为进一步探讨其作用机理,本研究利用血清药理学方法,观察积雪草在体外对肾小球系膜细胞的影响。

1  动物

    健康雄性Wistar 大鼠, ♀♂不限,体重140~180g ,共12只,用于体外肾小球系膜细胞培养。体重180~220g ,共6只,用于动物含药血清的制备。

2  试剂及实验用药

    胰蛋白酶、Ⅳ型胶原酶、Hepes (Sigma 公司产品) ,RPMI21640 (内含2mmol/ L2谷氨酰胺GIBCO 公司产品) ,特级胎牛血清(HyClone 公司产品) ,血管紧张素Ⅱ(AT Ⅱ Sigma 公司产品) ,积雪草购自江苏省中医院中药房。

3  主要仪器

    倒置相差显微镜( ECL IPSE TE300 型, 日本Nikon 公司) ,CO2 恒温培养箱( TC2323 型,美国Shelolon Manufacture公司) ,酶标仪(奥地利TECAN 公司Spectar Ⅲ) 。

方法

4  药物血清制备

    将6 只Wistar 大鼠随机分为2 组,即积雪草血清组、空白血清组,每组3 只。

    4.1  积雪草血清的制备 根据陈奇主编《中药药理学研究方法》,每日以成人剂量/ 公斤的10 倍,分2 次灌胃,连续3d ,最后1 日2 次给药间隔时间为2h ,并于末次给药后1~2h ,无菌操作,心脏取血,分离血清,并将含药血清置于56°C 水浴箱中30min 灭活处理, - 20°C 冰箱保存备用。

    4.2  空白血清制备 空白血清组大鼠每日灌服同药物剂量的生理盐水,在药物血清采血的同时采血,分离血清方法同前。

5  肾小球系膜细胞培养及鉴定

    参照谌贻璞报道的方法进行培养肾小球系膜细胞(MC) ,取培养第3 代MC ,经形态学及抗结蛋白抗体免疫组化染色鉴定后用于实验。

6  系膜细胞增殖及TGF2β1 的检测

    6.1  实验分组与给药取3 代MC ,用20 %FBSRPMI21640 培养液,以密度1 3105·mL - 1 转种于96 孔板内,200μL ·孔- 1 ,培养24h 后,用0. 5 %FBS RPMI21640 培养液200μL·孔- 1 ,培养24h ,使细胞

同步于G0 期。然后分为(1) 空白组: 加5 %空白血清; (2) 模型组:加AT Ⅱ10 - 6M 和5 %空白血清; (3) 低剂量组:加ATⅡ10 - 6M 和2. 5 %积雪草血清; (4) 中剂量组: 加AT Ⅱ10 - 6和5 %积雪草血清; (5) 高剂量组: 加AT Ⅱ10 - 6M 和10 %积雪草血清,每组设6 个复孔,并以FBS 将每孔的血清浓度补至15 % ,每孔培养液总量为200μL ,并于给药后4 ,8 ,16 ,32h分别检测TGF2β1 的含量。48h 测定MC 增殖情况。

    6.2  系膜细胞增殖的测定(MTT 法)

    将MTT 溶液(5mg·mL - 1) 加入长有MC 的96 孔板中,20μL·孔- 1 ,37°C、5 % CO2 条件下继续培养4h ,终止培养,小心吸弃孔内的上清液。每孔加入150μL DMSO (二甲基亚砜) ,振荡10min ,使结晶充分溶解。选择490nm 波长,在酶标仪上读出OD 值。

    6. 3  酶联免疫法(双抗体夹心法) 检测TGFβ1 的含量    参照Promega TGFβ1 EL ISA 试剂盒说明书进行。

7  结果

    7.1  积雪草对肾小球系膜细胞增殖的影响, 见表1

表1  系膜细胞增殖的测定结果

n

空白组

模型组

低剂量组

中剂量组

高剂量组

OD值

6

0.432±0.015

0.628±0.0111)

0.492±0.0162)

0.451±0.0122)

0.405±0.0112)

             

注:1)与空白组相比P < 0. 01 ,2)与模型组相比P < 0. 05 或P < 0. 01 。

  结果表明积雪草血清能抑制血清紧张素Ⅱ刺激下的系膜细胞增殖,并呈现一定的量效关系。

    7.2  积雪草对肾小球系膜细胞分泌TGF-β1 的影响,见表2

8  讨  论

    在慢性肾小球疾病中,系膜细胞(MC) 增殖和活化,伴随着细胞外基质(ECM) 的过度表达,导致了肾小球硬化的产生。故而设法控制MC 增殖、减少ECM 的聚集,对争取肾小球病变的逆转和防止肾小球疾病慢性演变至肾小球硬化有重要意义。

表2  积雪草对系膜细胞中TGF-β1 的影响(pg·mL - 1)

组别

n

4h

8h

16h

24h

空白组

6

600.21±30.2

680.28±44.12

620.74±36.28

580.46±42.31

模型组

6

936.3±60.261

960.8±68.441

978.81±78.661

997.75 ±42.38

低剂量组

6

891.51±63.31

850.6±68.27

875.29±45.58

901.24±68.462

中剂量组

6

821.5±49.682

835.81±47.422

812.54±43.272

839.32±57.472

高剂量组

6

801.2±44.512

811.64±38.462

796.21±46.472

776.62 ±53.282

注:1)与空白组相比, P < 0.01 ,2)与模型组相比P < 0.05 或P <0.01 。

  结果显示空白组大鼠系膜细胞的TGF-β1 的分泌量很少,模型组经血管紧张素Ⅱ刺激后, TGF-β1 的分泌量显著增加,提示血管紧张素Ⅱ能明显促进MC 分泌TGF-β1 。积雪草各组在各个时间点的TGF-β1 分泌量均减少,与模型组相比有明显差异P < 0.05 ,且呈剂量依赖关系,说明积雪草血清能明显抑制MC 分泌TGF-β1 。

  在慢性肾脏病进展过程中,MC 产生的细胞因子和生长因子如IL21 、IL28 、TNF2α、GM2CSF、M2CSF、PDGF、IGF21 、TGF2β1 以自分泌或旁分泌的机制促进MC 增殖,导致ECM聚集[1] ,进一步加重肾小球炎症和硬化过程。其中最重要的是TGF-β1 ,TGF-β1 能刺激ECM 蛋白基因的表达,抑制多种ECM 降解酶的合成,增加ECM 受体的表达,以促进ECM 与细胞粘附[2] 。

    积雪草是传统中药之一,主要成分有β2谷甾醇(β-sitosterol) ,胡萝卜苷(daucosterol) ,积雪草酸(asiaticacid) ,香草酸(vanillic acid) 和积雪草苷(asiaticosid e) [3] 。是临床治疗湿热型肾脏病的常用中药之一。因此我们运用积雪草含量血清作用于体外培养的肾小球系膜细胞,观察其对MC 增殖和分泌TGF-β1 的影响。结果表明:积雪草含药血清能明显抑制系膜细胞增殖,并呈现剂量依赖关系,同时对导致肾小球硬化的关键纤维化因子TGF-β1 也有明显的抑制作用。本实验是利用积雪草全草制备含药血清,作用于体外肾小球系膜细胞,而对其具体成分的研究,有待进一步深入探讨。

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