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学术文章

王钢论文《现代中西医结合杂志》肾炎灵诱导大

来源:未知 作者:njboda 时间:2016-02-25 09:48

文献出处《现代中西医结合杂志》 2005 Sep, 14(18)

肾炎灵诱导大鼠肾系膜细胞凋亡的研究

刘 丽, 王 钢, 倪 斌

( 江苏省中医院, 江苏南京210029)

摘  要   目的  研究肾炎灵对大鼠系膜细胞凋亡的影响。方法 取SD 大鼠肾脏进行肾系膜细胞体外培养, 用肾炎灵喂服系膜增生性肾炎大鼠, 以含药大鼠血清加入到体外培养的大鼠系膜细胞中, 应用倒置显微镜、光镜、流式细胞仪等观察、检测肾炎灵对系膜细胞凋亡的影响。结果   喂服肾炎灵大鼠的血清可诱导部分系膜细胞发生凋亡。结论   肾炎灵的作用机制可能与其诱导肾系膜细胞发生凋亡有关。

关键词 肾炎灵; 系膜细胞; 凋亡

中图分类号 R- 33   文献标识码 A    文章编号1008-8849( 2005) 18-2379- 02

Study of mesangial cell apoptosis in rats induced by Shenyanling,LIU Li, WANG Gang, NI Bin

( Tradit ional Chinese Medical Hospital of Jiangsu Province, Nanjing 210029, Jiang su, China)

Abstract: Objective It is to study the influence of Sheny anling on the apoptosis of mesangial cell in r ats. Methods T he kidneys of SD rats were gotten to cultivate t he mesangial cells in vitro . The serum from rats with mesangial proliferative nephritis which had been given Shenyanling was added to the mesangial cells above. The influence o f Shenyanling on t he apoptosis o f mesang ial cell were observed and detect ed with inverse microscope, optical microscope and flow cytometr y. Results T he serum from rats g iven Shenyanling could induce apoptosis of some rat mesangial cells. Conclusion The mechanism of Shenyanling maybe cor relates to it inducing apoptosis of mesangial cells.

Key words: Shenyanling; mesangial cell; apoptosis

    中药复方肾炎灵是本院经20 多年反复探索, 综合中医辨证辨病特点而研制的复方雷公藤制剂, 其对慢性原发性肾小球疾病、难治性肾病综合征有确切的临床疗效, 且能明显减轻患者的蛋白尿和血尿, 改善肾小管间质及肾功能损害[1- 2] 。本实验拟研究肾炎灵对体外培养大鼠肾脏系膜细胞凋亡的影响, 从细胞水平进一步深入探讨其作用机制。

1   材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物    远交系健康雄性SD大鼠35只, 体质量(150±21) g, 由南京中医药大学实验动物中心提供(实验动物使用许可证号SYXK(苏) 2001- 2010)。

1.1.2 药物及主要试剂    肾炎灵浸膏(主要成分有雷公藤、蜀羊泉、生黄芪等) 由连云港康缘制药有限公司生产, 批号010215。每克浸膏干粉合生药9.4g , 成人日用量生药0.75g/kg, 相当于肾炎灵片为0.08g/kg。RPMI 1640( GIBCO) 、胎牛血清(FCS, Hyclone) 、胶原酶IV型(Sigma)、MTT(Sigma)、胰蛋白酶(进口分装) 、HEPES(B. M.) 等。

1.1.3 主要仪器     重庆XDS- 1B 倒置生物显微镜, LDZ5-2 离心机, DKB- 8A 型电热恒温水槽, SW- CJ- 1F 净化工作台, Forma 3111 CO2 培养箱, FACS Calibur 流式细胞仪等。

1.2 方法

1.1.1 含药血清的制备    实验大鼠经适应性喂养1 周后, 随机分为正常组、模型组和肾炎灵剂量组, 每组10只。参照文献[3] 制作系膜增生性肾炎大鼠模型。肾炎灵治疗组自正式免疫第1 天开始给药, 根据文献[4]换算剂量, 肾炎灵剂量组每只大鼠每日用药剂量0.44g/kg(合生药4.14 g/kg) 。正常组灌服等量蒸馏水。全部大鼠于正式免疫8 周后分别经眼眶静脉丛取血, 所取大鼠血液经3000 r/ min 离心10 min 取血清, 56℃水浴30 min灭活, 0.22µm 无菌滤器过滤除菌, 分装,- 80℃保存备用。

1.2.2 细胞培养及鉴定     断头处死5只SD 大鼠, 快速取出肾脏, 无菌Hanks 缓冲液洗涤肾脏, 剥去肾包膜, 剪刀剪取肾皮质成小碎块, 分别经80 目、150 目、200 目不锈钢网筛过滤分离肾小球, IV型胶原酶37°C水浴消化, 间隔振摇约15 min。用不完全培养基离心洗涤后, 完全培养基悬浮肾小球, 接种于细胞培养瓶中, 镜下观察肾小球消化和密度情况, 37℃、5% CO2 静止培养。结蛋白、角蛋白免疫荧光鉴定系膜细胞。传代培养获得大量细胞后进行实验。

1.2.3 光镜观察      调细胞浓度为约166个/ mL, 取50~100µL 细胞悬液均匀涂布于载玻片上, 95%乙醇固定5 min, 滴加苏木精染液, 室温固定1 min, 用水轻洗去染液, 1%盐酸酒精分化10 s, 流水冲洗, 晾干, 光学显微镜下观察。

1.2.4 流式细胞仪检测      0.25%胰酶消化系膜细胞, 调细胞密度为约1×105个/ mL, 细胞培养瓶中预培养48 h。待系膜细胞完全贴壁后, 弃旧培养基, 将细胞分成3组: 10%正常大鼠血清;10%模型组血清;10% 肾炎灵剂量组血清。每组分别用FCS 补足血清浓度至20%, 37℃ 、5% CO2 条件下分别培养24, 48 h。每组设3个平行实验。培养结束后, 消化培养瓶内细胞, 1000r/min 离心5min, 弃上清液。PBS 工作液洗涤细胞2次, 调细胞密度为1×106个/mL, 将细胞悬浮于PI 低渗液中, 置4°C 染色约20min, 过滤, 流式细胞仪检测细胞凋亡率。统计方法采用t 检验。

2   结 果

2.1 倒置显微镜观察    含肾炎灵浸膏药物的血清作用后, 系膜细胞收缩明显, 间距增大, 胞质中颗粒物增多, 透明度降低,有部分细胞悬浮, 随时间延长漂浮细胞逐渐增多。对照组细胞生长状态良好, 透明度高, 细胞形态始终为梭形或星形等。

2.2 光镜观察    含药血清组的细胞胞膜完整, 染色质凝聚,嗜碱性增强, 染成深蓝色。对照组细胞形态正常。

2.3 流式细胞仪检测     见表1。由表1 可知, 24h、48h 处理组细胞, 正常组与模型组的凋亡率无显著性差异。处理24h,肾炎灵治疗组与正常组、模型组凋亡差异不显著; 处理48 h,肾炎灵治疗组与正常组、模型组凋亡差异显著, 凋亡峰见图1。

表1 10%含药血清对大鼠系膜细胞凋亡率的影响(x±s,%)

组别

24h凋亡率

48h凋亡率

正常组

0.250±0.236

2.893±0.519

模型组

0.110±0.072

3.470±0.588

肾炎灵组

1.640±1.457

5.663±0.640①②

注: ①与正常组比较, P<0.01; ②与模型组比较, P<0.05。

3 讨 论

    系膜细胞是肾小球的固有细胞之一, 正常情况下肾小球系膜细胞仅行使收缩、吞噬及维持基质的正常代谢等功能。然而病理情况下系膜细胞能出现明显的增殖, 以炎症为主的肾小球疾病早期均伴有明显的系膜细胞增殖。系膜细胞过度增殖, 一方面突入肾小球毛细血管腔, 导致管腔狭窄或闭塞;另一方面又可产生大量的细胞外基质, 促进肾小球硬化。因此, 若能有效地控制系膜细胞增殖, 则可减缓肾小球疾病的进一步恶化。

    本实验肾炎灵剂量组血清由造模动物喂服中药后而获得, 这与一般的从喂服中药的正常大鼠中获取血清不同, 它是病理状态下治疗疾病后的血清, 其既内含中药有效成分又可能内含疾病状态下机体代谢的相关成分, 因此用造模后喂服中药的血清做实验更能反映药物的治疗机制。

 

图1 流式细胞仪检测( 示凋亡峰)

注: a. 24h 正常组; b. 24h 模型组; c. 24h 肾炎灵组;

d. 48h 正常组; e. 48h 模型组; f. 48h 肾炎灵组

中药复方肾炎灵具有健脾益肾、益气养阴、清热利湿解毒、活血化瘀的功效。本实验结果表明肾炎灵治疗肾小球疾病的有效作用机制, 与其诱导肾系膜细胞发生凋亡有关。细胞凋亡是与细胞坏死有着本质区别的一种生理性调控机制,形态学上可见到细胞核染色质凝集、趋边化, 细胞缩小等。凋亡与增殖是调控细胞数目稳态、作用相反的一对机制, 细胞凋亡与肾脏疾病的发生、发展及转归均密切相关[5] 。研究表明,系膜细胞的增生和细胞外基质的积聚是导致肾小球硬化的主要因素, 而细胞凋亡可使增生的肾小球系膜细胞数量恢复正常[6] 。因此, 诱导细胞凋亡将有利于清除过度增生的肾小球系膜细胞, 阻止肾小球硬化的进一步发展。

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