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LOX - 1 对食盐敏感性高血压大鼠肾损害进展的影响

来源:未知 作者:njboda 时间:2014-10-30 21:10

文献出处:《中国中西医结合肾病杂志》   2005 年10 月第6 卷

LOX - 1 对食盐敏感性高血压大鼠

肾损害进展的影响及中药干预作用

王钢 仲昱 孔薇 刘丽 贾宁人 周恩超 邹燕勤

 

    〔摘 要〕 目的:围绕内皮氧化低密度脂蛋白受体(LOX - 1) 与高血压和肾损害的机制,从分子生物学方面探讨中药保肾片对LOX - 1 以及细胞增殖因子TGF - β、细胞外基质主要成分Ⅰ型胶原的影响。方法:对DS、DR 系大鼠半数予以高食盐饮食,其余予对照饮食,另设高食盐饮食+ 中药保肾片高、低剂量2 组。4 周实验结束后断头处死,切取肾脏,测定有关生化指标,并提取总RNA ,RT -PCR 处理制备探针,Northern blot 测定LOX -1 、TGF -β、Ⅰ型胶原的mRNA 表达。结果: (1) 服用8 %高食盐的DS 大鼠主动脉及肾脏LOX-1 mRNA 表达显著上调。(2) 高食盐DS 大鼠LOX-1 升高同时可见TGF -β和Ⅰ型胶原mRNA 表达增加。(3)DS 高食盐大鼠见到血压升高,血胆固醇、甘油三酯升高,血肌酐升高,尿蛋白排泄增多。(4) 中药保肾片与对照组相比,DS 8 %高食盐大鼠的LOX-1 、TGF-β、Ⅰ型胶原的mRNA 表达显著降低,血压、血脂、血肌酐、尿蛋白亦见明显下降。结论: (1)LOX- 1 在高血压大鼠的主动脉上mRNA表达上调,可能与内皮依赖性血管舒张的损害有关。(2) 食盐敏感性DS 大鼠的高血压肾损害进展与LOX - 1 升高、多种细胞增殖因子及细胞外基质产生增加有关。(3) 保肾片可显著降低LOX -1 的mRNA表达及TGF -β、Ⅰ型胶原的产生,降低血压和蛋白尿,改善脂质水平和肾损害。中药保肾片治疗慢性肾衰竭、延缓高血压肾损害进展的作用机制与降低肾脏中LOX -1 、TGF -β及Ⅰ型胶原的mRNA 表达有关。

〔关键词〕 内皮氧化低密度脂蛋白受体 肾损害 保肾片 动物实验

Effect of Baoshenpian Tablet on the Gene Expression of Oxidized Lowdensity Lipoprotein

Receptor and Cytokines in Experimental Hypertensive Glomerulosclerosis

WANG Gang , ZHONG Yu , KONG Wei , et al

Nephrology Center of Traditional Chi nese Medici ne , the Fi rst A f f liated Hospitalof N anji ng University of Traditional Chi nese Medici ne ,

N anji ng (210029)

  ABSTRACT Objective :To investigate the effect of the Chinese Herbal Medicine Baoshenpian tablet on oxidized low -

density lipoprotein receeptorl (LOX - 1) , transforming growth fator -β( TGF -β) ,type I collagen (Col Ⅰ) in Dahl salt - sen2sitive (DS) rats fed with high - salt (8 % NaCl) diet and the moleculobiological mechanism of LOX - 1 in hypertension andrenal damage. Methods :Two groups of rats were studied :DS rats and DR rats. Half of rats in each group were fed with high- salt diet ,the rest were fed with low - salt diet . Another two groups of DS rats with high - salt diet were given high or lowdose of Baoshenpian tablet . After 4 weeks of treatment ,kidneys were excised for extraction of RNA and preparing of probe byreverse - tranion - PCR. The LOX - 1 , TGF - βand Col ⅠmRNA expression was assessed by Northern blot analysiswhile some biochemical indices were observed. Results :LOX - 1 mRNA expression in the aorta was significantly elevated inhypertensive DS 8 % rats. The upregulation of LOX - 1 in DS8 % rats was accompanied by renal overexpression of TGF - βand Col Ⅰ,impaired renal function and elevated Bp and serum lipid ,all of which were ameliorated by Baoshenpian tablet .Conclusion :(1) The upregulation of LOX - 1 in the aorta of hypertensive rats may be related to the lesion of endothelium -derived vasodiatory effects. (2) The renal overexpression of LOX - 1 , growth factors and extracellular matrix proteins are re2sponsible for renal damage in hypertensive rats. (3) Chinese Herbal MedicineBaoshenpian tablet can downregulate the geneexpression of LOX - 1 ,TGF - βand Col and can decrease Bp ,serum lipid , urinary protein excretion and serum creatinine.The therapeutic mechanism of Baoshenpian tablet in delaying the progress of hypertensive renal damage may be relateditsdownregulation of the expression of LOX - 1 , TGF -βand Col Ⅰ.

KEY  WORDS  Oxidized low - density lipoprotein receptor1  Dahl salt - sensitive rats  Dahl salt - resistant rats  Baoshenpian tablet  Laboratory animals

    内皮氧化低密度脂蛋白受体1 (LOX -1) 是C型植物凝集素家族的一种膜蛋白,参与了动脉粥样硬化和内皮依赖性血管舒张效应损伤的病理过程。近年来发现LOX - 1 在肾小球内皮细胞上和系膜细胞上也可表达。因此本实验拟研究, (1) LOX - 1是否是导致肾小球硬化症的一种调节因子; (2) 若LOX- 1 与肾小球硬化的进展有关,那么LOX - 1与已经明确的肾小球硬化的细胞增殖因子、细胞外基质成分关系如何; (3) 保肾片是全国著名中医肾病专家邹云翔教授治疗慢性肾衰竭的经验方,多年来在临床运用取得明显效果,保肾片延缓慢性肾衰竭进展的作用机制是否与调节LOX - 1 和多种细胞增殖因子及细胞外基质成分有关,我们进行了相关研究。

材料与方法

1  实验材料

1.1  实验动物 参照文献选用食盐敏感性(DS) 和食盐抵抗性(DR) 大鼠,4 周龄,健康雄性,购自日本静冈县动物中心实验室,平均体重(200 ±25) g。

1.2  实验药物 保肾片由连云港康缘制药有限公司提供(批号:980403) ,每克浸膏含生药7.2g ,参照成人日用量58 g/ 60 kg , 用蒸馏水配制成10.8g/ml 、5.4g/ ml 二种浓度混悬液。

1.3  主要试剂 DNA 随机引物标记试剂盒(Promega) ;限制内切酶( Takara) mRNA 纯化试剂盒( Pharmacia) ; Pfu 多聚( Stratagene) ; (α- 32 P)dCTP (Amersham) 。

1.4  实验饲料和条件 8 %、0.3 % NaCl 大鼠颗粒饲料,随意进食进水,室内湿度控制在60%~90 % ,温度控制在16℃~22 ℃。

2  实验分组 每个系的半数大鼠予以含8 %NaCl 的高盐饮食,其余予0. 3 %NaCl 的低盐对照饮食,另取2 组高食盐DS 大鼠,分别灌服高低剂量保肾片,共喂养4 周。(1) DS 8 %高食盐组: 雄性DS 大鼠7 只,予8 %NaCl 高食盐饮食,喂养4 周。

(2) DR 8 %高食盐组: 雄性DR 大鼠7 只,予8 %NaCl 高食盐饮食,喂养4 周。(3) DS 0.3 %低食盐组:雄性DS 大鼠7 只,予0.3 %NaCl 低食盐饮食,喂养4 周。(4) DR 0.3 %低食盐组:雄性DR 大鼠7 只,予0. 3 % NaCl 低食盐饮食、喂养4 周。(5)DS8 %高食盐+ 保肾片高剂量组:雄性DS 大鼠7 只,予8 %NaCl 高食盐饮食。保肾片每日剂量43.3 g/ kg ,相当于人体用药量42 倍,以10.8g/ml 保肾片混悬液每日2 次灌胃给药,喂养4 周。(6) DS 8 %高食盐+ 保肾片低剂量组:雄性DS 大鼠7 只,予8 %NaCl 高食盐饮食。保肾片每日剂量10. 8 g/ kg ,相当于人体用药量10.5 倍,以5.4 g/ml 的保肾片混悬液每日2 次灌胃给药,喂养4 周。

3  检测方法

3. 1  探针制备 用RT - PCR 合成大鼠LOX- 1的cDNA。PCR 引物: 5′- CTGGMTCTGGCAT2GRAGAAA - 3′和5′- YGCCTTCTTYTGACATATACTG- 3′。重复95 ℃变性1 min ,43 ℃退火1 min ,75 ℃延伸3 min ,共进行35 个循环,PCR 产物克隆到pBlue Ⅱ上,并双向测序。核

苷酸顺序分析揭示该产物长361 bp ,与牛及人相应部位的LOX - 1 cDNA 分别有75.8 %及77.7 %的同源性,氨基酸顺序含有121 个残基,相应的与牛及人的LOX - 1 蛋白质分别有67.8 %与68.6 %的同源性,采用随机引物标记法将(α- 32 P) dCTP 标记到探针上。

3. 2  RNA 制备 实验结束时,大鼠断头处死,解剖主动脉、静脉、肺和肾,立即置于液氮中冷冻, - 80 ℃下贮存备用,用酸化胍基硫氰酸盐/ 氯仿方法提取总的RNA。用mRNA 纯化试剂盒提取mRNA。

3. 3  Northern blot 分析 将DS、DR 大鼠主动脉、肾脏中提取的总RNA 20μg 在1. 2 %甲醛琼脂凝胶电泳上分离,设GAPDH 为内对照,转移到尼龙膜上,含50 %甲酰胺溶液中,42 ℃下与(α- 32P) 标记探

针杂交16 h 。室温下膜在2 ×SSC、0.1 %SDS 冲洗2 次,在0. 1 ×SSC、0.1 % SDS 中于68 ℃冲洗1 h ,然后在下用加强荧光将滤膜曝光于Kodak Bio Max MS底片上或曝光于成像板上,进行扫描并用BAS 2000型生物图像分析仪进行定量分析。

3.4  血压、血脂及肾功能测定 实验4 周结束时,采用夹尾方法测定大鼠血压,眼眶后静脉丛穿刺取血,测定血胆固醇、甘油三酯及血肌酐水平,代谢笼收集12 h 尿液测定尿蛋白排泄。

4  统计学方法 所有数据用(x-±s) 表示,采用SPSS 10. 0 统计软件t检验处理。

结  果

1  动物模型

1.1  一般表现 高食盐组DS 大鼠表现出活动迟缓,倦怠乏力,毛耸稀疏,进食减少,生长缓慢等表现。低食盐DS 大鼠和高食盐组DR 大鼠一般表现基本正常。

1.2  LOX -1 的mRNA 表达 Northern blot分析DS 8 %高食盐大鼠在4 周时主动脉和肾脏LOX - 1 mRNA 表达明显升高( 与DR 8 %、DS0. 3 %和DR 0. 3 %组比较, P < 0. 01 , P < 0. 05) 。见图1 、表1 。

1.3  肾脏TGF - β和Ⅰ型胶原的mRNA 表达 DS 8 %高食盐组肾脏的TGF - β和Ⅰ型胶原的mRNA 表达与DS 0. 3 %组比较均见到显著的增高(P <0.01 , P < 0.05) 。见图2 、表1 。

1.4  DS 和DR 大鼠血压、血脂、尿蛋白及肾功能的变化 DS 高食盐组大鼠实验4 周时见到血压、血脂、蛋白尿以及血肌酐升高,与DR 8 %、DS0. 3 %和DR 0.3 %组比较, 有统计学差异(P <0.05 , P < 0.01) 。见图3~图5 、表2 。

2  治疗结果

2.1  保肾片对DS 8 %高食盐大鼠肾脏LOX- 1mRNA 表达的影响 Northern blot 分析DS 8 %高食盐大鼠加用保肾片高、低二组剂量治疗4 周,与DS 8 %高食盐组大鼠相比,肾脏LOX - 1 mRNA 均明显下调( P < 0.01 , P <0.05) 。见图6 、表1 。

2.2  保肾片对DS 8 %高食盐大鼠肾脏TGF -β和Ⅰ型胶原mRNA 表达的影响 Northernblot 分析DS 8 %高食盐大鼠同时加用保肾片高、低二组剂量治疗4 周后, TGF -β和Ⅰ型胶原mRNA表达水平均明显下降(P <0.01 ,P <0.05) 。见图7 、表1 。

2.3  保肾片对DR 和DS 大鼠血压、血脂、尿蛋白及肾功能的影响 保肾片高、低二组剂量治疗4 周后,血压下降;胆固醇和甘油三酯降低;尿蛋白减少;肾功能损害恢复正常( P < 0.05 , P < 0.01) 。保肾片二组剂量相比,高剂量组尿蛋白明显低于低剂量组( P < 0.05) 。见图3~图5 、表2 。

 各组主动脉和肾LOX - 1 、肾TGF -β、肾Ⅰ型胶原的mRNA 表达及保肾片的干预作用 (x- ±s)

组别

鼠数

主动脉LOX- 1

肾LOX - 1

肾TGF - β

肾Ⅰ型胶原

DS 8%

7

0.12±0.0017

0.052±0.015

0.98±0.21

1.05±0.17

DR 8%

7

0.0010±0.0004**

0.005±0.009**

0.49±0.12*

0.54±0.08*

DS 0.3%

7

0.0011±0.0009**

0.007±0.013*

0.39±0.14**

0.26±0.09**

DR 0.3%

7

0.0012±0.0006*

0.001±0.0004**

0.46±0.13*

0.27±0.10**

DS 8%+保肾片高剂量组

7

        -

0.010±0.007**

0.58±0.17*

0.61±0.11**

DS 8%+保肾片低剂量组

7

        -

0.040±0.011*

0.69±0.16*

0.85±0.14*

 注:与DS 8 %组比较, *P < 0.05 , **P < 0.01

 各组血压、血脂、尿蛋白及血肌酐的变化和保肾片的干预作用 (x- ±s)

组别

鼠数

收缩压(mmHg)

胆固醇

(mg/ dl)

甘油三酯

(mg/ dl)

尿蛋白

(mg/ dl)

血肌酐

(mg/ dl)

DS 8%

7

250±20

140±16

164±24

35±14

0.58±0.17

DR 8%

7

155±24**

63±9.1**

51±7.5**

2.6±0.6**

0.35±0.11*

DS 0.3%

7

145±25**

71±20**

137±14*

2.4±0.7**

0.45±0.14

DR 0.3%

7

130±15**

58±12**

72±10**

2.5±0.9**

0.48±0.19

DS 8%+保肾片高剂量组

7

150±11**   

80±11**

124±14*

7.5±2.3**

0.31±0.08*

DS 8%+保肾片低剂量组

7

225±25    

94±14*

160±18

14±3.2**

0.35±0.12*

 注:与DS 8 %组比较, *P < 0.05 , *P < 0.01 ;与DS 8 % + 保肾片低剂量组比较, P < 0.05

讨  论

        高血压肾损害主要是指高血压引起的肾脏硬化性改变[1] 。未经治疗的高血压患者可有42 %发展为肾脏硬化性损害,大约10 %死于肾衰竭。现代研究表明,血流动力学因素和脂代谢紊乱在其进展和恶化过程中起重要作用。LOX - 1 是氧化低密度脂蛋白的受体[2] ,在肾小球内皮细胞和系膜细胞上亦可见到其表达[3 ] ,参与了动脉粥样硬化和内皮依赖性血管舒张效应损伤等病理损害。本次实验中发现DS 高食盐组大鼠的主动脉上和肾脏中LOX - 1 mRNA 表达明显上调,血压、血脂升高的同时,见到血胆固醇、甘油三酯升高,尿蛋白排泄增多,肾功能减退,血肌酐异常(见图3~图5) ,另4~8 周后肾脏的病理并出现细胞增殖和硬化,以及一些纤维素样坏死[3] ,符合高血压肾损害的临床和病理特点。因此,本研究结果提示高食盐可诱发DS大鼠肾脏损害,同时发现,LOX - 1 在肾脏的表达也明显增高,回答了假设1 所提出的问题,即高血压肾小动脉硬化与LOX - 1 的表达失衡有关。

        对于LOX - 1 在DS 8 %高食盐大鼠肾脏表达的上调,究其原因考虑: (1)与系统血压有关。高食盐DS 组大鼠血压升高的同时LOX - 1 表达上调,结合我们以往的研究认为可能与内皮依赖性血管舒张效应减弱,加重高血压有关,并能被降压药物所阻断[4 ] 。( 2) 与高脂血症有关。LOX -1 是Ox -LDL的受体,可在肾小球系膜细胞及内皮细胞上表达[3 ] ,并因Ox -LDL 的升高而上调。这种配体介导受体上调的负反馈抑制的丧失,可能是形成本病恶性循环, 不断进展的重要原因。Ox -LDL/ LOX -1 系统不仅作用于动脉硬化,有可能参与了高血压性肾小球硬化的过程。LOX -1 在肾脏的表达亢进,能进一步增加小球内压[5 ] ,并通过系膜细胞过度摄取Ox -LDL ,产生与血管平滑肌相似反应,即系膜细胞增生和系膜基质产生过多,进入肾小球硬化的前期,除此以外,随之而产生的黏附分子、生长因子及细胞因子等异常增加,损伤肾小球及间质,促进了肾脏硬化。

        一般认为,肾小球硬化症的进展除了血流动力学因素及脂代谢紊乱外, TGF -β、PDGF 等等非血流动力学因子也与之有关。目前LOX - 1 活化的链级反应尚未完全阐明[3 ] 。Tat suya 等[6 ]发现某些炎症因子可调节LOX -1 的表达。Ox -LDL 亦可诱导细胞因子和生长因子产生[7 ]。目前TGF -β被认为是肾小球硬化的关键性因素,对细胞外基质的沉积和小球损害起主要作用[8 ] 。我们在实验中发现高食盐DS 大鼠LOX -1 升高同时, TGF -β和Ⅰ型胶原也增加(见图1 、图2) 。本研究结果说明了假设2 提出的问题:LOX -1 与TGF -β相互作用,增加内皮细胞和系膜细胞损害,细胞外基质的蓄积,促进了高血压性肾小球硬化的进展。

        保肾片是著名中医肾病专家邹云翔教授治疗慢性肾衰竭的经验方,根据高血压肾损害的主要病机肾虚湿瘀,治从补益肾元、和络利湿泄浊入手,由何首乌、菟丝子、怀牛膝、泽泻、制大黄组成。主要成分有蒽醌类衍生物,槲皮素,齐墩果酸,泽泻醇(alisol) 等。可通过抑制肾小球系膜细胞DNA 和蛋白合成,抑制系膜细胞生长,诱导其发生凋亡,减慢残余肾组织肾小球硬化的进展。此外还可选择性抑制肾小管细胞的高代谢状态,降低肾小管上皮细胞增殖,从而减轻健存肾单位的损害[911 ] 。以往的临床研究表明保肾片能显著延缓肾衰竭进展,减少进入尿毒症人数,改善患者的临床症状,近期有效率84.5 % ,5 年进入尿毒症终末期的患者人数降为32.95 %( P < 0.05 , P < 0.01) [1] 。本次实验发现,中药保肾片可明显减少DS 8 %高食盐大鼠肾脏LOX - 1 mRNA 的表达(见图6) ,下调DS 8 %高食盐大鼠肾脏TGF-β和Ⅰ型胶原产生(见图7) ,同时具有降低血压,降低胆固醇、甘油三酯,减少蛋白尿作用(见图3~图5) 。本实验结果回答了假设3提出的问题,即保肾片能保护肾功能,对肾脏LOX- 1mRNA表达的降低,以及下调细胞因子TGF -β和细胞外基质成分Ⅰ型胶原的mRNA 表达,降低血压,改善血脂,是其肾保护作用的机制之一。

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